近日，宁波大学海洋学院姜海波教授团队联合中国科学院水生生物研究所龚阳敏副研究员团队，针对真核微藻合成生物学研究中普遍存在遗传筛选标记匮乏及标记残留问题开展研究，以模式产油硅藻——三角褐指藻为底盘细胞开发了无痕筛选标记回收及迭代整合系统。研究成果以“Iterative pathway engineering of the diatom Phaeodactylum tricornutum to enhance the biosynthesis of long-chain polyunsaturated fatty acid using the Cre recombinase-mediated marker recycling”为题在植物学领域权威期刊《New Phytologist》上在线发表（图1）。

图1. 研究成果在New Phytologist期刊上发表（原文链接https://doi.org/10.1111/nph.70829）

三角褐指藻富含多不饱和脂肪酸、色素和抗氧化剂等天然成分，在制药、化妆品及食品工业中具有广泛应用潜力。然而对于三角褐指藻的开发仍存在缺乏精准的同源重组整合工具、有限的筛选标记种类以及缺乏高效的遗传标记回收系统等问题。为解决三角褐指藻遗传改造中存在的筛选标记匮乏的问题，本研究首先在三角褐指藻中建立源自噬菌体P1的 Cre/loxP 重组系统。Cre重组酶可识别特异的loxP序列，并有效切除两个loxP位点之间的选择标记。研究中在首先通过在Cre序列中插入来源于三角褐指藻内源基因nr（Phatr3_J54983）、40S-S4（Phatr3_J18559）和Phatr3_J51169的内含子序列，避免了在原核表达中的自切除现象。进一步研究表明，cre序列插入Phatr3_J51169的内含子在藻细胞中表达转录后，可被高效剪切并翻译成完整的Cre蛋白序列。该 Cre 重组酶可有效去除在藻基因组上整合的两个同向 loxP 序列之间的筛选标记基因（图2）。

图2. Cre重组酶在藻细胞中的功能验证

为了便于后续藻株中Cre重组酶的去除，进一步将cre基因以复制型质粒的形式转化藻株。通过结合转移转化导入该复制型质粒，也可以成功实现对筛选标记基因的去除。增加该质粒上的cre表达盒的拷贝数可以显著提高对筛选标记的去除效率（图3）。

图3. 复制型Cre载体在硅藻细胞中的功能验证及优化

为了解析三角褐指藻EPA合成通路中碳链延长/去饱和等各步骤的限速酶，对各个延长酶/去饱和酶均进行单基因过表达实验。结果显示，ptD0-1、ptDes9、ptDes12、ptDes6、ptELO6B_1、ptELO6B_2、ptDes5A和ptDes5B单基因过表达藻株的EPA相对含量均较野生型显著提高，其中ptDes6、ptDes5A和ptDes5B单基因过表达藻株的提高分别可达到7.6%、13.1%和7.6%。

对上述三角褐指藻内源的延长酶和去饱和酶对EPA合成的促进效果进行同一标准评估后，分两步进行多基因过表达实验。最终获得的工程藻株Pt_EEJ17-2中EPA相对含量从野生型的25%提高到31%。导入复制型Cre表达系统对筛选标记基因进行去除并在无抗条件下传代丢弃游离质粒后，获得多基因过表达的无筛选标记基因工程藻株。其EPA相对含量仍可和标记基因除去前保持一致。最终该工程藻株在培养条件优化后，在L1培养基中EPA产量可达36 mg/L，EPA体积产率可达3 mg/L/day。

宁波大学海洋学院是该研究的第一完成单位，我院2021级博士研究生朱骏凯为该论文第一作者，我院姜海波教授和中国科学院水生所龚阳敏副研究员为本文的共同通讯作者。该研究得到国家自然科学基金联合基金（U24A20610）和“农药与化学生物学教育部重点实验室”开放课题（KL202509）等项目的资助。